Generación y caracterización de una línea iPSC humana de control y derivada del paciente que contiene la mutación compuesta heterocigota asociada a Hermansky Pudlak tipo 2 (HPS2) en AP3B1

Oct 19, 2021Investigaciones

Abstracto

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se generaron a partir de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) obtenidas de un donante sano y de un paciente diagnosticado con síndrome de Hermansky Pudlak tipo 2 (HPS2), causado por mutaciones heterocigotas compuestas AP3B1 (c.177delA y c.1839-1842delTAGA).

Los BOEC fueron reprogramados con un vector lentiviral policistrónico autosincónico hOKSM, donde las iPSC generadas mostraron cariotipo normal, expresión de marcadores asociados a la pluripotencia y diferenciación espontánea in vitro hacia las tres capas germinales. Las iPSC generadas se pueden utilizar para estudiar la fisiopatología HPS2 y las funciones básicas de la proteína AP3B1 en diferentes tipos de células.

 

1. Tabla de recursos

Identificador único de líneas de células madre
  1. SANi009-A

2) SANi010-A

Nombres alternativos de líneas de células madre
  1. PBL.HPS241.cl2

HPS2-90

2) PBL.5486.cl3

WT-30

Institución Sanquin, Ámsterdam, Países Bajos
Información de contacto del distribuidor Emile van den
Akker [email protected]
Tipo de líneas celulares iPSC
Origen Humano
Fuente de celda Células endoteliales de crecimiento sanguíneo (ECO)
Clonalidad Clonal
Método de reprogramación Lentivirus, vector viral integrador
Justificación multilínea Par de control y enfermedad
Modificación genética Sí (sólo SANi009-A)
Tipo de modificación Hereditario (sólo SANi009-A)
Enfermedad asociada Síndrome de Hermansky Pudlak tipo 2
Gen/locus Gen AP3B1, Locus 5q14, Mutación c.177delA y c.1839-1842delTAGA
Método de modificación
Nombre del transgén o resistencia
Sistema inducible/constitutivo
Fecha de archivo/fecha de existencias 13-06-2017
Repositorio/banco de líneas celulares https://hpscreg.eu/cell-line/SANi010-A https://hpscreg.eu/cell-line/SANi009-A
Aprobación ética El consentimiento informado se dio de conformidad con la Declaración de Helsinki y las juntas nacionales holandesas y de ética interna de Sanquin. Febrero 2015

2. Utilidad de recursos

HPS2 es un trastorno autosómico recesivo poco frecuente y está causado por mutaciones en el gen AP3B1. Dado que el material del paciente puede ser escaso, la línea celular establecida es una buena alternativa para estudiar el mecanismo de la enfermedad en diferentes tipos de células. Además, la línea iPSC SANi010-A puede funcionar como línea celular de control.

3. Detalles del recurso

Se recolectaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente con mutaciones en el gen AP3B1 que codifica para la subunidad β1 del complejo heterotetrérico AP-3. El paciente es un heterocigoto compuesto donde las mutaciones (exón 2: c.177delA; exón 17: c.1839-1842delTAGA) conducen a un cambio de marco y un codón de parada prematuro (de Boer et al., 2017). Se ha descrito que estas mutaciones causan el síndrome de Hermansky Pudlak tipo 2, que es un trastorno autosómico recesivo raro, que afecta a 1 de cada 500,000 personas en todo el mundo. Los pacientes con HPS2 sufren de neutropenia severa y otras inmunodeficiencias (de Boer et al., 2017).

Las células endoteliales del crecimiento sanguíneo (EPC) se derivaron de PBMC de un paciente con HPS2 y un donante sano (no emparentado)(Tabla 1). Ambos BOEC fueron transducidos con el autoinactivante pRRL.PPT.SF.hOct34co.hKlf4co. hSox2co.hmyc.idTomato.preFRT vector lentiviral (Voelkel et al., 2010, Warlich et al., 2011). La reprogramación se realizó en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (iMEF), donde las colonias similares a iPSC se recogieron individualmente 17-21 días después de la transducción. Las líneas iPSC SANi009-A (HPS2) y SANi010-A (WT) iPSC mostraron una morfología similar a la de las células madre embrionarias(Fig. 1A, barra de escala 1000 μm (Tabla 2)) y mostraron cariotipo normal después de la reprogramación sin anomalías cromosómicas(Fig. 1B). Ambas líneas iPSC reprogramadas lenti-viralmente fueron negativas para dTomato, lo que indica el silenciamiento del cassette de reprogramación(Fig. 1C).

La presencia de la enfermedad causante de la mutación heterocigota compuesta (exón 2: c.177delA; exón 17: c.1839-1842delTAGA) fue confirmada por secuenciación del ADN de Sanger, mientras que la línea iPSC de tipo salvaje SANi010-A no mostró estas mutaciones(Fig. 1 suplementaria). Las células SANi009-A y SANi010-A también mostraron una coincidencia del 100% mediante el análisis de repetición corta en tándem (STR) entre iPSC y células parentales(archivo STR suplementario). La tinción alcalina de fosfatasa(Fig. 1D, barra de escala 400 μm) y la expresión positiva de los marcadores SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1–60, TRA-1–81 y NANOG(Fig. 1E, F) por citometría de flujo e inmunotinción, confirmaron la pluripotencia de las líneas iPSC generadas. El potencial de diferenciación espontánea in vitro de las líneas iPSC hacia las tres capas germinales se demostró mediante la expresión de marcadores ectodérmicos (βIII-TUBULIN), mesodérmicos (BRACHYURY) y endodérmicos (GATA4)(Fig. 1G) mediante tinción inmunocitoquímica. Ambas líneas de iPSC fueron negativas para micoplasma(Fig. 2suplementaria).

Tabla 1. Caracterización de líneas iPSC derivadas de un paciente HPS2 y un donante sano (no emparentado).

Nombres de línea iPSC Abreviatura en cifras Género Genotipo del locus Enfermedad
SANi009-A HPS2 Hembra c.177delA, c.1839-1842delTAGA Síndrome de Hermansky-Pudlak tipo 2
SANi010-A WT Hembra Sano