La secuenciación del gen de la tirosinasa (TYR) y la revisión de la literatura revelan mutaciones recurrentes y múltiples mutaciones del gen fundador de la población como causantes del albinismo oculocutáneo (OCA) en familias paquistaníes

Introducción

El albinismo oculocutáneo no sindrómico (nsOCA) es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por la pérdida parcial o completa de pigmentación en la piel, el cabello y los tejidos oculares que se debe a una disminución o ausencia de la producción de melanina [1]. Otras características clínicamente importantes asociadas con OCA son la hipoplasia foveal, el desvío de los nervios ópticos en el quiasma, la fotofobia, el nistagmo y el deterioro de la visión [2]. La prevalencia del albinismo en todo el mundo se ha estimado en 1 de cada 17.000, lo que indica que ~ 1 de cada 70 personas son portadoras del alelo OCA a nivel mundial [3].

 

La OCA no sindrómica se divide en siete subtipos (OCA1-7) sobre la base de pruebas genéticas. El albinismo oculocutáneo tipo 1 (OCA1) es la variante más común de OCA que afecta a casi el 50% de los individuos afectados en todo el mundo [4, 5]. Clínicamente, OCA tiene una amplia presentación clínica, siendo OCA1A el subtipo más grave con falta absoluta de biosíntesis de melanina durante toda la vida, lo que resulta en cabello y piel completamente blancos. Otros subtipos de OCA (OCA1B, OCA2, OCA3, OCA4 y OCA7) muestran un grado de pigmentación de melanina con la edad avanzada, dando lugar a una amplia gama del color de la piel, el cabello y los ojos, aunque la pigmentación sigue siendo típicamente menor que los individuos no afectados. Debido a los fenotipos clínicos indistinguibles y la participación de diferentes genes, el diagnóstico molecular se ha convertido en una herramienta importante para identificar con precisión el tipo y la gravedad de la OCA para ayudar al diagnóstico genético, el asesoramiento y para considerar el desarrollo terapéutico [6, 7].

 

Hasta la fecha, las variantes patogénicos en seis genes, TYR, OCA2, TYRP1, SLC45A2, SLC24A5 y C10orf11,se han identificado en individuos con nsOCA [8]. En una familia pakistaní, se ha identificado previamente un posible locus para una forma de nsOCA en el cromosoma 4q24 [9], para el cual el gen permanece indefinido. En estudios poblacionales publicados, sin embargo, la tasa de detección de alelos que causan albinismo varía de 60 a 90% [10, 11]. OCA tipo 1 se asocia por mutación en el gen tyrosinase TYR (MIM# 606933), que abarca cinco exones codificantes y se encuentra en el cromosoma 11q14.3. La enzima tirosinasa tiene un papel fundamental en la biosíntesis de melanina en los melanocitos, ya que cataliza las dos primeras reacciones de la vía de síntesis de melanina: formación de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) por hidroxilación de tirosina y producción de dopaquinona por la oxidación de L-DOPA. Estos dos pasos son cruciales para la síntesis de melanina [12], y los defectos en la actividad catalítica de la tirosinasa debido a la mutación TYR pueden resultar en ausencia completa o disminución de la pigmentación de la piel, los ojos y el cabello, dependiendo de la actividad enzimática residual [13]. OCA1A (MIM# 203100) es el fenotipo clínico más grave caracterizado por una ausencia casi completa de pigmentación de la piel, el cabello y el iris, y asociado con alelos patógenos o nulos en TYR. Las mutaciones TYR menos graves pueden manifestarse como OCA1B (MIM # 606952), lo que resulta en un fenotipo más leve y extremadamente variable debido a la disminución pero no completamente abrogada de la actividad de la tirosinasa y los niveles bajos a moderados de pigmentación de melanina en los individuos afectados [4, 14].

 

Materiales y métodos

Pacientes y familiares

Este estudio implica la investigación genética de ocho familias paquistaníes reclutadas con consentimiento informado con aprobación ética (Junta Ética de la Universidad de Ciencias de la Salud, Lahore). Todas las familias provienen de la provincia de Punjab, con distintos orígenes étnicos: (1) Khokhar (Sahiwal), (2) Chadhar Jutt (Chiniot), (3) Arain (Gujranwala), (4) Malik Awan (Lahore), (5) Mughal (Lahore), (6) Gujjar (Lahore), (7) Saraki Somro (Rahim Yar khan) y (8) Turk Pathan (RYK). Las familias diagnosticadas con OCA y con dos o más miembros afectados fueron incluidas en este estudio, mientras que las familias con albinismo ocular y OCA sindrómica fueron excluidas. Después del diagnóstico de una pro-banda en cada pedigrí, se obtuvieron más detalles clínicos para cada familia visitando oftalmólogos de hospitales locales colaboradores. Las imágenes clínicas de los individuos afectados se tomaron con consentimiento para documentar las características fenotípicas y confirmar el estado de la enfermedad. También se tomaron videos para su posterior estudio. Los exámenes oftálmicos se completaron utilizando los mejores recursos disponibles localmente, que incluyen: pruebas de agudeza visual utilizando LogMAR Visual Acuity Chart (LVRC) Numbers Distance, pruebas de visión del color utilizando tablas de Ishihara y examen funduscópico por oftalmoscopia directa. Los hallazgos se registraron en los formularios de datos especificados.

 

Análisis genético molecular

Se tomaron muestras de sangre venosa periférica en EDTA que contenía tubos de vacutainer de cada individuo participante para la extracción de ADN genómico, como se describió anteriormente [4]. Un individuo afectado de cada familia fue secuenciado para los cinco exones codificantes y las uniones intrón-exón asociadas en el gen TYR. Las lecturas de secuencia se alinearon con la secuencia de referencia del genoma humano [hg19] para observar los cambios en el par de bases utilizando el software BioEdit, el visor de secuencias CLC(https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-sequence-viewer/)y el software Chromas Lite(http://technelysium.com.au/wp/chromas/). Se secuenciaron muestras de ADN de las familias de los probands que mostraron mutaciones putativas en un individuo afectado para confirmar la segregación con el fenotipo de la enfermedad. Las herramientas de predicción de patogenicidad in silico aplicadas fueron SIFT (<0,05), PolyPhen2 Hum Var (posiblemente perjudicial y probablemente perjudicial) y GERP + + (>2) [14]. La estructura cristalina de la proteína tirosinasa humana (PDB ID 5M8Q) [15] se utilizó como plantilla para la construcción de la estructura tridimensional (3D) de la proteína tirosinasa salvaje y mutante. Los modelos fueron visualizados utilizando UCSF-quimera (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/). RAMPAGE se utilizó para la evaluación y validación de las estructuras 3D modeladas [16].

 

Resultados

Hallazgos clínicos

Ocho familias con nsOCA congénita se inscribieron de diferentes ciudades dentro de la provincia de Punjab de Pakistán (familia 1 de Sahiwal, familia 2 de Chiniot, familia 3 de Gujranwala, familias 5, 6, 7 de Lahore, familias 7 y 8 de Rahim Yar Khan). El modo aparente de herencia en todas las familias fue consistente con un trastorno autosómico recesivo, y todos los individuos afectados exhibieron las características clínicas cardinales de OCA con cabello rubio blanco a dorado, piel blanca de pálido a rojizo, disminución de la agudeza visual de extensión variable, nistagmo, estrabismo y fotofobia. El examen oftalmológico de todos los individuos afectados reveló las características oftálmicas clásicas del albinismo, a saber: hipoplasia foveal, nistagmo, estrabismo y un fondo de fondo hipopigmentado. Los hallazgos clínicos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1 Características clínicas observadas en familias de AOO

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Hallazgos genéticos

La secuenciación de las regiones codificantes del gen TYR reveló una nueva mutación sin sentido chr11:88911429G>A [hg19]; c.308G>A; p.Cys103Tyr en el primer exón codificante de TYR en pedigrí de la familia 1 de OCA (Fig. 1a, b), que se segregó adecuadamente en la secuenciación (Fig. 1c). Los análisis in silico se realizaron utilizando diversas herramientas de predicción de patogenicidad, como PolyPhen-2 y SIFT, lo que indica que esta variante es probablemente perjudicial (Tabla 2). Se identificaron otras cinco variantes de sentido insensorio de TYR; chr11:89018011G>A [hg19]; NM_000372.4: c.1255 G>A; p.Gly419Arg en las familias 2, 3 y 4, chr11:88911393 G>A [hg19]; NM_000372.4: c.272 G>A; p.Cys91Tyr en la familia 7, y c.715 C>T; p.Arg239Trp en la familia 8, y también se identificaron dos mutaciones sin sentido; c.346 C>T; p.Arg116Ter en la familia 5, y g.89191214; NM_000372.4: c.832 C>T; p.Arg278Ter en la familia 6 (Fig. 2a–g). La variante TYR, c.308 G>A, identificada en este estudio no figura en forma homocigota en la base de datos genómica gnomAD en línea(http://gnomad.broadinstitute.org),y la variante también estuvo ausente en 150 cromosomas de ascendencia pakistaní emparejados por edad y sexo.

Figura 1

a Pedigrí familiar que muestra TYR c.308 G> A variante e imagen b de los individuos afectados. c el análisis de cosegregación de esta familia establece la variante TYR chr11:88911429 G >A [hg19]; c.308 G >A; p.Cys103Tyr. Las muestras parentales fueron heterocigotas, y los hermanos no afectados fueron portadores wt o heterocigotos y alineación de aminoácidos d utilizando ClustalW que muestra una alta conservación del residuo Cys103 a través de vertebrados.

 

Tabla 2 Variantes de TYR (NM_000372.4) nuevas e informadas identificadas en las familias OCA de este estudio

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Figura 2

Pedigríes de siete familias con albinismo oculocutáneo separándose para mutaciones TYR (MIM# 606933). La presencia o ausencia de la variante se indica mediante un signo + o −, respectivamente. a–c. Representación pedigrí de tres familias (familia 2-4) con mutación c.1255G>A, d. pedigrí con la variante c.346C>T, e. familia 6 con mutación c.832C>T, f. familia 7 con c. 272G>A y g. familia 8 con mutaciones c. 715C>T

 

Análisis comparativo de homología y homología de proteínas

La alineación clustal W de las proteínas tirosinasas de varias especies mostró la conservación de los residuos de cisteína en la posición 103 entre ocho especies. Los aminoácidos conservados se muestran con un fondo gris oscuro, y los aminoácidos no conservados se muestran con un fondo blanco (Fig. 1d). En el caso de la estructura de tipo salvaje, el Cys103 estableció el enlace disulfuro con el cercano Cys112 (Fig. 3a, b). Debido a la sustitución de cistina por tirosina en la posición 112 pierde el enlace disulfuro (Fig. 3c). Esta alteración estructural podría influir en la función de la proteína y, por lo tanto, en la razón para causar OCA1. El servidor RAMPAGE generó la gráfica Ramachandran para el tipo salvaje mostrada el 90,3% de los residuos se encuentran en la región más favorecida, mientras que el 8,6% de los aminoácidos residen en la región generosamente permitida (Fig. 3d). Según la gráfica de Ramachandran generada para la estructura con mutación sin sentido, el 91,3% de los residuos se encuentran en la región más favorecida, mientras que el 7,4% de los aminoácidos residen en la región generosamente permitida (Fig. 3e).

Figura 3

a Estructura tridimensional de la tirosinasa que muestra la posición del residuo Cys103 a través del modelo de palo, b Vista de cerca de la tirosinasa normal y c de tipo mutante, d la gráfica de Ramachandran para la proteína AAAS de tipo silvestre modelada que presenta el 90,3% de los residuos se encuentran en las regiones más favorecidas, el 8,6% de los residuos se encuentran en las regiones más permitidas y el 1,1% de los residuos se encuentran en las regiones atípicas, e la gráfica de Ramachandran para la variante mutante modelada c.308 G>A, el 91,3% de los residuos se encuentran en las regiones más favorecidas, el 7,4% de los residuos se encuentran en las regiones más permitidas y el 1,3% de los residuos se encuentran en las regiones atípicas

 

Discusión

Nuestro estudio destaca la importancia de la carga genética de la mutación del gen TYR para la prevalencia de las familias de albinismo de Pakistán. Los paquistaníes tienen un rico trasfondo antropogénico debido a las sucesivas oleadas de invasiones y emigraciones, aunque la mayoría de los grupos no se mezclaron con la población local original y practicaron la endogamia, dando lugar a aislamientos genéticos que persisten hoy en día. Se ha documentado que la consanguinidad parental conduce a una mayor incidencia de trastornos genéticos recesivos [17]. En Pakistán, el 62,7% de los matrimonios son consanguíneos, ~ 80% de los cuales son entre primos hermanos [18], y el matrimonio dentro de clanes y la alta consanguinidad en Pakistán son una causa común de una mayor incidencia de trastornos recesivos, incluida la OCA.

 

La tirosinasa, una oxidasa que contiene cobre, es la enzima que limita la velocidad en la vía de biosíntesis de la melanina. Cataliza las dos primeras reacciones de la vía de síntesis de melanina: formación de DOPA y luego DOPA quinona posteriormente. Aproximadamente un tercio de los casos de OCA en Pakistán se deben a una mutación en TYR [7]. En este estudio, identificamos una nueva y cinco mutaciones previamente informadas en TYR asociadas con OCA en familias de diferentes regiones de Pakistán. La nueva mutación TYR (c.308 G> A; p. Cys103Tyr) se identificó en una familia del distrito de Sahiwal (provincia de Punjab) de Pakistán. Los individuos afectados de esta familia presentaban características típicas, que incluían cabello blanco (teñido de negro en el momento de la toma de muestras), piel de color blanco rojizo a blanco con cicatrices de quemaduras solares en la cara y los brazos, nistagmo, fotofobia grave (no puede salir durante el día) y de -Iridos grises transparentes pigmentados con disminución de la agudeza visual. La variante no figura en las bases de datos genómicas en línea, lo que indica que es probable que sea muy poco común en esta población. Las herramientas patógenas in silico establecen el efecto deletéreo de esta nueva mutación. La alineación de la secuencia de aminoácidos utilizando el programa ClustalW 2.1 mostró una alta conservación del residuo Cys103 en vertebrados relacionados. La mutación p.Cys103Tyr se encuentra en la región altamente conservada de esta enzima tirosinasa, que se prevé que altere la función enzimática. Debido a esta mutación, la orientación configuracional de TYR se reformó y condujo a la estructura rígida en la naturaleza.

 

Este estudio también identificó mutaciones previamente reportadas en siete familias de OCA, que incluyen c.272 G>A, c.346 C>T, c.715 C>T, c.832C> T y c.1255 G>A. Hasta la fecha, los datos publicados describen >200 familias OCA de poblaciones pakistaníes que se han sometido a análisis genéticos. De estas familias, 81 familias (~40%) se han asociado con variaciones genéticas en el gen TYR (Tabla suplementaria 1). Las mutaciones reportadas en este estudio ahora se han descrito con frecuencias variables en familias pakistaníes, incluyendo mutaciones muy raras / únicas (Tabla suplementaria 1):c.346 C>T y c.715 C>T [19] en solo 2 familias [20], así como mutaciones más comunes: c.832 C>T en 17 familias [4, 7, 20,21, 22] y c.1255 G>A en 16 familias [4, 7, 19, 22]. Si bien no es posible determinar de manera concluyente si las mutaciones TYR comunes representan puntos calientes de mutación versus mutaciones del gen fundador sin análisis genéticos más detallados, la evidencia para apoyar ambos mecanismos está presente en la literatura. Varias de las mutaciones TYR descritas en nuestro estudio se asocian comúnmente con OCA en Pakistán, y probablemente representan tanto mutaciones fundadoras regionales como recurrentes (hotspot). Por ejemplo, el c.832 C> T; p.Arg278Ter c.1255 G>A; p.Gly419Arg variantes en TYR identificadas en las familias 2, 3, 4 y 6, representan el 21%, y el 19,75% de todas las familias con variantes conocidas de TYR en Pakistán, respectivamente [4, 7]. Si bien la frecuencia de la variante c.832 C>T es mayor en la población pakistaní, la mutación también se ha identificado en muchas otras poblaciones en todo el mundo, lo que indica que probablemente ha ocurrido de forma recurrente, aunque una mayor frecuencia de la variante en algunas áreas puede indicar que también se ha acumulado como una mutación fundadora regional (Guayanan 12.5%; Judío 2,6%; japonés 22,2%; Europeo 2,5%; Mexicano 0.83%; Indio 0.83% y 4.34%; India Oriental 8,3%; Siria 0,83%; Chino 18.75%) [22]. De acuerdo con esto, la variante se enumera en las bases de datos del genoma en línea, que ocurre (en gnomAD) con mayor frecuencia en la población del sur de Asia (frecuencia de alelos = 0.0013) que en otras regiones (por ejemplo, las frecuencias de alelos en poblaciones africanas y europeas son 0.0001249 y 0.00002372, respectivamente).

 

El estudio actual identificó la variante c.1255 G>A como el alelo más común de TYR presente en el grupo étnico Punjabi. Tres familias de este estudio, y cinco familias de estudios previos con c.1255 G>A, son originarias de la misma área geográfica (Punjab) y del mismo grupo étnico (grupo lingüístico Punjabi). Esta variante también se ha documentado en otras etnias paquistaníes, incluidos los orígenes sindhi, cachemir y balochi, y en conjunto representa el 19,75%, de todas las familias de Pakistán conocidas por tener la mutación TYR (Tabla suplementaria 1). La alta frecuencia de la variante en la población pakistaní es similar a la frecuencia en la población india (20% indio; Sur de la India 16,6%), aunque notablemente esta mutación ocurre mucho menos comúnmente en la población blanca caucásica (0,83%; de las familias identificadas) [23]. En conjunto, esto puede indicar que la variante c.1255 G>A puede representar una mutación fundadora que se ha acumulado en la región del subcontinente Indo-Pakistán, y de acuerdo con esto, la variante ocurre con mayor frecuencia en poblaciones del sur de Asia en bases de datos en línea (la población de GnomAD del sur de Asia es 0.0003899, en comparación con la frecuencia europea de 0.00003967). De acuerdo con esto, la variante aún no se ha reportado en otras poblaciones fuera de estas regiones.

 

También determinamos que la variante c.230 G>A ha sido reportada en poblaciones japonesas, coreanas, chinas y europeas [12, 23,24,25,26,27]. Si bien esto puede indicar que la variante ha ocurrido recurrentemente, solo se ha reportado en comunidades en la región pakistaní de Cachemira [19], por lo que mientras ocurre recurrentemente puede representar nuevamente una mutación fundadora regional de importancia en esta área de Pakistán. Del mismo modo, c.62 C>T; p.Pro21Leu, c.103 T>C; p.Cys35Arg, c.1231 T>C; p.Tyr411His [24], c.240 G>C; p.Trp80Cys [3], c.308 G>A; p.Cys103Tyr (asociado a fotofobia severa, este estudio) y c.593 T>C; p.Ile198Thr [20] sólo se han reportado en comunidades pakistaníes específicas, y no fuera de Pakistán. Esto probablemente indica que cada variante también puede representar variantes fundadoras regionales. Por el contrario, las variantes c.346 C>T; p.Arg116Ter [19], c.649 C>T; p.Arg217Trp [7, 23], c.896 G>A; p.Arg299His [7, 22] y la variante del sitio de empalme c.1037–7 T>A [7, 19,20,21,22] han sido reportados en diferentes grupos étnicos de Pakistán, así como de otros países. Por lo tanto, estas (y varias otras) variantes pueden representar mutaciones TYR recurrentes en todo el mundo.

 

En general, la prevalencia de alelos TYR en Pakistán (37%) es similar a las frecuencias en familias de Europa (46%), aunque en gran medida diferente a los estudios en diferentes poblaciones. Por ejemplo, las variantes TYR y OCA2 representan el 70 y el 10% de la OCA en un estudio de 127 pacientes de una población china, con una variación regional notable [23]. En la India, un estudio de 82 pacientes con OCA reveló ~ 60% de prevalencia de la mutación TYR [28]. Del mismo modo, en los Estados Unidos, Europa, Italia, Japón y Corea, los alelos de TYR son la causa más común de OCA [25]. En contraste, las variantes en OCA2 representan ~ 80% de los casos de OCA en una población africana [29, 30].

 

En conclusión, está claro que la presentación clínica de OCA está causada por una amplia variedad de mutaciones en múltiples genes. Por lo tanto, por razones económicas y geográficas, no es factible realizar rutinariamente la secuenciación de Sanger de todos los genes OCA conocidos para detectar defectos genéticos subyacentes. Juntos, nuestros datos y estudios destacan la importancia y amplían el conocimiento actual del espectro molecular y las frecuencias específicas de la mutación del gen TYR en OCA en las comunidades pakistaníes, lo que indica que una serie de mutaciones del gen TYR probablemente involucran mutaciones del gen fundador. Debido a la frecuencia de mutaciones en el gen TYR, que comprende solo cinco exones codificantes, la secuenciación dirigida de TYR puede ser apropiada (donde los paneles de secuenciación más amplios son prohibitivamente caros), para proporcionar información valiosa para ayudar al diagnóstico y asesoramiento de las personas afectadas y los miembros de la familia en todo Pakistán.

 

Resumen

Lo que se sabía antes

El albinismo oculocutáneo no sindrómico (nsOCA) es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por la pérdida parcial o completa de la pigmentación en la piel, el cabello y los tejidos oculares. La OCA no sindrómica se divide en siete subtipos (OCA1-7), sobre la base de pruebas genéticas. Se han identificado alrededor de 300 mutaciones en TYR.

 

Qué añade este estudio

Una novela c.308 G>A; p.Cys103La mutación Tyr de TYR puede causar albinismo oculocutáneo. La modelización de proteínas predijo el cambio en la configuración de la estructura y función de la proteína. Una actualización sobre la revisión de las mutaciones TYR para el efecto fundador en diferentes grupos étnicos de la población pakistaní.

 

Recopilado y traducido al español desde www.nature.com
(Publicado originalmente el 17 de Abril 2019)

 

CITA: Shakil, M., Harlalka, G.V., Ali, S. et al. Tyrosinase (TYR) gene sequencing and literature review reveals recurrent mutations and multiple population founder gene mutations as causative of oculocutaneous albinism (OCA) in Pakistani families. Eye 33, 1339–1346 (2019). https://doi.org/10.1038/s41433-019-0436-9

 

DOI: https://doi.org/10.1038/s41433-019-0436-9