Caracterización de la cinética dependiente de la temperatura de los mutantes causantes de albinismo oculocutáneo de la tirosinasa

Nov 26, 2021Investigaciones

  1. Introducción

Las mutaciones en el gen de la tirosinasa(TYR)causan albinismo oculocutáneo tipo 1 (OCA1), un trastorno autosómico recesivo caracterizado por una falta de biosíntesis de melanina o una reducción del pigmento de melanina en el cabello, la piel y los ojos. OCA1, el tipo más común de albinismo, es causado por mutaciones bialélicas en el gen TYR con una prevalencia estimada de 1:40.000 a nivel mundial [1]. Dependiendo de la gravedad de la mutación, OCA1 se divide en dos subtipos, OCA1A y OCA1B. OCA1A es el tipo más grave de OCA1, lo que lleva a una falta completa de producción de melanina debido a la pérdida de actividad de la tirosinasa (Tyr). Los pacientes con OCA1A tienen una ausencia de pigmentación de por vida y presentan cabello blanco y pestañas, piel pálida e áridos translúcidos [2]. A diferencia de OCA1A, OCA1B se caracteriza por una menor actividad de Tyr y la producción de melanina en comparación con las personas no afectadas. Los pacientes con OCA1B tienen hipopigmentación en la piel y el cabello con la capacidad de broncearse, acumulando pigmento de melanina con la edad. Sin embargo, ambos subtipos de OCA1 tienen características comunes, incluyendo nistagmo, hipoplasia foveal con agudeza visual reducida y decusación anormal de los axones de células ganglionares en el quiasma óptico [1]. A pesar de la identificación de más de 350 mutaciones en el gen TYR, actualmente, no existe un tratamiento efectivo para OCA1, por lo que es un área de investigación activa [1,2,3]. Un estudio reciente de Teramae et al. que utilizó células HeLa para expresar Tyr mutante demostró que la terapia con chaperona química ofrece una modalidad de tratamiento prometedora para recuperar las actividades de Tyr de pacientes con OCA1A con ciertos tipos de mutaciones sin sentido de TYR [4].

Sin embargo, la termodinámica y la cinética de las variantes mutantes de Tyr aún no se han dilucidado para comprender los mecanismos por los cuales las mutaciones contribuyen al fenotipo de pigmentación diversa en OCA1 y para recuperar la actividad de Tyr en los pacientes. Estudios previos in vivo [5] e in vitro [6] han demostrado que hay variantes mutantes sensibles a la temperatura de Tyr que causan OCA1. Por ejemplo, R422Q conduce a un defecto de tráfico sensible a la temperatura que restringe la translocación del mutante Tyr en melanosomas, donde tiene lugar la melanogénesis. A 37 °C, R422Q se retiene en el retículo endoplásmico (RE) y se degrada por proteasomas, lo que resulta en ninguna pigmentación, mientras que a 31 °C se transloca con éxito en el melanosoma, produciendo pigmento. Este fenómeno se observa en pacientes con OCA1B, presentando pelo blanco en las zonas más cálidas (cuero cabelludo y axila) y progresivamente más oscuro en las zonas más frías (extremidades) [5,7,8]. El papel de la temperatura en la estructura y función de Tyr necesita una mayor exploración para comprender mejor los mecanismos involucrados en OCA1. Además, hasta donde sabemos, no se ha informado del papel de las temperaturas en la producción de dopacromo, especialmente en variantes mutantes.

El Tyr humano es una de las tres enzimas clave involucradas en la vía de la melanogénesis, que resulta en la producción de pigmentos de melanina. Tyr es una glicoenzima que contiene cobre que cataliza el paso inicial y limitante de velocidad en la cascada de reacciones que conducen a la producción de melanina a partir de tirosina [9]. Esta metaloenzima está hecha de 529 aminoácidos, incluyendo una secuencia de péptidos de señal N-terminal, subdominio rico en cisteína (el dominio EGF), dominio de hélice alfa transmembrana C-terminal, dos sitios de unión al cobre y siete sitios de N-glicosilación. El modelo de homología de Tyr se muestra en la Figura S11 de Materiales Suplementarios. La glicosilación post-traducción asegura una maduración, estabilidad y función adecuadas de Tyr. El sitio activo de Tyr contiene dos átomos de cobre unidos por un ligando aquo (hidroxo) y ligados a seis residuos de histidina (H180, H202 y H211 en CuA y H363, H367 y H390 en CuB) [3,9,10]. La estabilidad de los iones de cobre dentro del sitio activo de Tyr depende de la presencia de una molécula de dioxígeno puente. Como se ha demostrado en experimentos computacionales anteriores, la eliminación de este puente puede conducir a un desorden activo en el sitio con una falta de coordinación de los seis residuos de histidina [11]. Tyr cataliza los dos primeros pasos de la vía de la melanogénesis, la hidroxilación de L-tirosina a L-3, 4-dihyroxyphenyl-alanine/L-DOPA (actividad monofenolasa/paso limitante de la velocidad), y la posterior oxidación de L-DOPA a L-dopaquinona (actividad de la difenolasa). Luego, la L-dopaquinona se convierte espontáneamente en un intermediario de color marrón anaranjado conocido como dopacromo a través de la ciclización intramolecular y el intercambio redox [12,13]. La actividad de la tyr difenol oxidasa se puede controlar midiendo la producción de dopacromo a 475 nm [14]. Tyr también cataliza la oxidación del intermedio 5,6-dihidroxiindol (DHI) a indol-5,6-quinona y del ácido 5,6-dihidroxiindole-2-carboxílico (DHICA) a ácido carboxílico indol-5,6-quinona [15]. Como enzima que cataliza el paso limitante de la velocidad de la vía de la melanogénesis, Tyr desempeña un papel central en la producción de eumelanina y feomelanina.

Nuestro grupo previamente purificó y caracterizó la tirosinasa humana truncada de tipo salvaje (WT) recombinante y variantes mutantes de T. ni. biomasa larvaria [1,2,16]. Estas caracterizaciones revelaron que existe un vínculo entre la estabilidad conformacional de Tyr y su actividad enzimática. Hemos demostrado que el WT es una glicoproteína monomérica soluble, que se modifica post-traslacionalmente en el RE mediante la adición de varios glicanos ligados a N. La glicosilación juega un papel vital en la maduración, estabilidad y translocación de Tyr desde el RE al citoplasma. Los mutantes desglicosilados de Tyr exhiben una disminución moderada a dramática en la actividad específica de L-DOPA, dependiendo del grado de desglicosilación [1,2]. También hemos demostrado que los mutantes relacionados con OCA1A (T373K y R77Q) y los mutantes relacionados con OCA1B (R402Q, R422W, R422Q y P406L) influyen en el plegamiento de proteínas, la estabilidad y la actividad intrínseca. La Km los valores de las variantes mutantes WT y OCA1B fueron similares, lo que implica afinidades de unión a L-DOPA similares, pero el recambio enzimático disminuyó para las variantes mutantes [1]. Posteriormente, una menor rotación condujo a una disminución de la producción de dopacromo y melanina. Sin embargo, nuestras evaluaciones previas de la reacción de la difenol oxidasa de las variantes mutantes de Tyr solo se realizaron a 31 y 37 ° C. Además, hemos demostrado una correlación entre los cambios en la estabilidad de las proteínas y la actividad específica mediante el uso de equilibrio inducido por la urea que se despliega / repliebla de WT y variantes mutantes. Los WT, R402Q y R422Q repegados mostraron curvas de respuesta nativas, mientras que R422W y P406L exhibieron histéresis. Las proteínas WT y R422W mostraron cambios similares de energía libre (ΔG), mientras que R402Q, R422Q y P406L exhibieron una menor estabilidad (mayor ΔG). Por lo tanto, las mutaciones causantes de OCA1B inhiben la vía de plegamiento de Tyr a la conformación de menor energía, lo que a su vez podría disminuir la actividad catalítica debido a la conformación perturbada [1].

Recientemente, examinamos la cinética dependiente de la temperatura del WT utilizando la cinética de Michaelis-Menten y el análisis de Van’t Hoff, demostrando que la asociación de L-DOPA con el WT es una reacción espontánea impulsada por la entalpía [17]. En el presente estudio, caracterizamos la cinética dependiente de la temperatura y las firmas termodinámicas de WT y dos mutantes OCA1B de Tyr, R422Q y P406L, utilizando actividades de difenol oxidasa a 28, 31, 37 y 43 ° C. Bajo las mismas condiciones experimentales, realizamos simulaciones computacionales de la asociación de L-DOPA y Tyr. Para obtener los parámetros cinéticos y termodinámicos, se utilizaron los análisis de Michaelis-Menten y Van’t Hoff. También evaluamos el papel de la temperatura en la producción de dopacromo a través de la reacción de difenol oxidasa. Nuestros resultados revelaron, por primera vez, que la asociación de L-DOPA con R422Q y P406L es una reacción compleja apoyada por fuerzas de entalpía y entropía. Además, mostramos que el WT tenía un mayor número de facturación en comparación con R422Q y P406L. Además, la producción de dopacromo aumentó con el aumento de la temperatura para WT, R422Q y P406L, pero fue significativamente mayor para el WT a todas las temperaturas examinadas. Elucidar la cinética y termodinámica de las variantes mutantes de Tyr en OCA1B ayuda a comprender los mecanismos por los cuales disminuyen la actividad catalítica de Tyr. Esto, a su vez, podría acelerar la búsqueda de nuevos compuestos que puedan recuperar la actividad de Tyr en pacientes con OCA1B. En el futuro, además de los estudios in vitro, los estudios in vivo de naturaleza similar junto con la investigación de otros mutantes avanzarían nuestra comprensión de los mecanismos en OCA1B y conducirían a descubrimientos de nuevas terapias para pacientes con OCA1B.

  1. Resultados

2.1. Purificación de proteínas

Las proteínas WT, R422Q y P406L se purificaron como se describió anteriormente [10,16]. Brevemente, la cromatografía de afinidad de metales inmovilizada (IMAC) fue seguida por dos pasos de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Se realizó el ensayo colorimétrico Tyr con L-DOPA para identificar fracciones que contenían las proteínas de interés. Los pasos de purificación fueron monitoreados por SDS-PAGE y Western blot para evaluar la pureza y la identidad, respectivamente. En los Materiales Suplementarios, la Figura S1 muestra el perfil SEC de Tyr después de la purificación utilizando un Superdex 200 Increase GL 10/300 (GE Healthcare, Silver Spring, MD, USA) o una columna Superdex 75 16/60 HR (GE Healthcare, Silver Spring, MD, USA), SDS-PAGE y Western Blot. La purificación(Materiales Suplementarios Figura S1,Panel A y D) demostró que WT, R422Q y P406L elute como proteínas monoméricas con pesos moleculares estimados de 58, 56 y 61 kDa, respectivamente. Como se muestra en la Figura S1 de Materiales Suplementarios (Paneles B, C, E y F), el SDS-PAGE ilustró una proteína altamente pura con una sola banda, mientras que el Western Blot confirmó la identidad de Tyr utilizando anticuerpos anti-Tyr (T311). Además, el SDS-PAGE y el Western Blot para los mutantes revelaron bandas con pesos moleculares como el de la proteína WT.

Después de cada paso de purificación, las fracciones que contenían Tyr se identificaron mediante una evaluación de la actividad enzimática de los analitos en las fracciones, midiendo la actividad de la difenol oxidasa de Tyr [2]. La actividad se midió espectrofotométricamente a 475 nm utilizando una relación 1:1 del analito y 3 mM de sustrato L-DOPA. La producción de un dopacromo anaranjado-marrón confirmó la presencia de un Tyr activo en una fracción.

2.2. Cinética dependiente de la temperatura

Estudios previos han demostrado que la temperatura regula la producción de melanina en los melanocitos y han confirmado la existencia de mutantes sensibles a la temperatura de la tirosinasa [7,18,19]. Sin embargo, el papel de la temperatura en las variantes mutantes de Tyr no se entiende bien. Aquí, medimos la dependencia de la temperatura de la actividad catalítica de WT, R422Q y P406L y examinamos su cinética para comprender el mecanismo molecular del albinismo oculocutáneo. Las actividades enzimáticas se midieron in vitro como se describe en la sección Métodos bajo cinética de Michaelis-Menten. La constante de afinidad Km y velocidad máxima Vmáximo obtenidos de las gráficas de Michaelis-Menten se muestran en la Figura 1,y luego se calcularon los parámetros cinéticos adicionales mostrados en la Figura 2 y en la Tabla de Materiales Suplementarios S1.

Figura 1. Análisis cinético de mutantes relacionados con WT y OCA1B. Los paneles(A–D)muestran las gráficas de Michaelis-Menten de la actividad de la difenol oxidasa de WT, R422Q y P406L en función de la concentración de L-DOPA medida a temperaturas crecientes. WT, R422Q y P406L se muestran en negro, rojo y púrpura, respectivamente. Cada punto de datos representa el promedio de mediciones duplicadas, con barras de error que representan las desviaciones estándar.

Figura 2. Parámetros cinéticos de mutantes relacionados con WT y OCA1B a temperaturas crecientes. La Km/ 5máximo, kgato, y la eficiencia enzimática aumentó con el aumento de la temperatura tanto para las variantes WT como mutantes, como se muestra en los paneles(A–D),respectivamente. Sin embargo, el WT exhibió una V más alta.máximo, kgato, y la eficiencia enzimática en comparación con las variantes mutantes. WT, R422Q y P406L se muestran en marrón, naranja y azul, respectivamente. Cada punto de datos representa el promedio de mediciones duplicadas, con barras de error que representan las desviaciones estándar.

La actividad de la difenol oxidasa mostró un aumento de Vmáximo, kgato, y la eficiencia catalítica a medida que la temperatura aumentó de 28 a 43 °C(Figura 2 y Tabla S1 de Materiales Suplementarios). La Vmáximo (nmol/min) varió de 0.50 ± 0.02 a 1.12 ± 0.06 para WT y mostró valores disminuidos de 0.28 ± 0.01 a 0.67 ± 0.03 para R422Q, y de 0.40 ± 0.02 a 0.79 ± 0.03 para P406L. El kgato (min−1) osciló entre 5,55 ± 0,22 a 12,44 ± 0,66 para WT, de 3,11 ± 0,11 a 7,44 ± 0,33 para R422Q, y de 4,44 ± 0,22 a 8,78 ± 0,33 para P406L, lo que sugiere que el número de volumen de negocios se caracterizó por kgato se rechaza para las variantes mutantes de Tyr. La eficiencia catalítica (mM−1 min−1) varió de 26,43 ± 5,14 a 41,47 ± 8,58 para WT y decayó para las variantes mutantes de 16,37 ± 2,65 a 27,56 ± 4,26 para R422Q y de 22,20 ± 3,51 a 26,61 ± 3,38 para P406L. La Vmáximo, kgato, y los valores de eficiencia fueron más altos para el WT en comparación con las variantes mutantes a todas las temperaturas, lo que indica una interrupción parcial de la función de Tyr causada por las mutaciones (Figura 2). En contraste, tanto en WT como en variantes mutantes, el Km los valores fueron similares para 28 y 31 °C, pero aumentaron para 37 y 43 °C con una magnitud similar(Figura 2 y Tabla S1 de Materiales Suplementarios). A diferencia de los otros parámetros cinéticos, el Km los valores fueron muy similares para WT, R422Q y P406L a cada temperatura examinada.

2.3. El papel de la temperatura en la producción de dopacromo

También evaluamos el papel de la temperatura en la producción de dopacromo a través de la reacción de difenol oxidasa de Tyr. Las actividades de la difenol oxidasa de WT, R422Q y P406L se midieron en las condiciones de temperatura descritas en la sección Métodos. Los primeros 30 min de la reacción de difenol oxidasa se utilizaron para analizar la producción de dopacromo. Estos experimentos revelaron que el dopacromo aumenta con el aumento de la temperatura. Aunque los experimentos se realizaron para concentraciones de L-DOPA que oscilan entre 0,094 y 6,0 mM, la Figura 3 muestra los resultados de las actividades de difenol oxidasa para el sustrato de L-DOPA de 3 mM.

Figura 3. El papel de la temperatura en la producción de dopacromo. Las actividades de la difenol oxidasa se determinaron utilizando 0,05 mg/mL tyr y 3 mM L-DOPA como sustrato. Las mediciones de absorbancia (mOD) de la producción de dopacromo a 475 nm se obtuvieron después de ejecutar las reacciones en las condiciones de temperatura durante 30 min. WT, R422Q y P406L se muestran en marrón, naranja y azul, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y las barras de error representan desviaciones estándar.

Como se muestra en la Figura 3 y en la Figura S2 de Materiales Suplementarios,la producción de dopacromo es mayor para el WT en comparación con R422Q y P406L a todas las temperaturas evaluadas aquí. Sin embargo, tanto en las variantes WT como mutantes, la producción de dopacromo está aumentando linealmente con la temperatura, de acuerdo con la siguiente ecuación D = Pd × T − Do (Materiales complementarios Figura S2). Aquí D, Pd, Do, y T son la producción de dopacromo, la tasa de producción de dopacromo, la producción de dopacromo a 0 °C y la temperatura (°C), respectivamente. Los valores correspondientes de estos parámetros para la proteína WT y las variantes mutantes se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Producción de dopacromo dependiente de la temperatura en la reacción de la difenol oxidasa WT, R422Q y P406L.

En línea con los datos cinéticos, la literatura y la presentación clínica, observamos una disminución de la producción de dopacromo en variantes mutantes en comparación con el WT, lo que significa una disminución de la actividad del mutante Tyr. La disminución de la producción de dopacromo, a su vez, conduce a una reducción de la producción de melanina.

2.4. Firma termodinámica aparente de la formación de dopacromo

La firma termodinámica aparente de la producción de dopacromo fue determinada por la medición de la constante de Michaelis-Menten (Km) seguido de un análisis utilizando la ecuación de Van’t Hoff. Para explicar las propiedades de temperatura de la interacción, asumimos que L-DOPA se asocia con Tyr. La asociación indica una línea de tendencia negativa en la gráfica de Van’t Hoff. La Figura 4 muestra que Van’t Hoff traza las pendientes para las reacciones WT, R422Q y P406L difenol oxidasa, lo que reveló que las reacciones son exotérmicas (ΔH < 0).

Figura 4. Las tramas de Van’t Hoff de WT y variantes mutantes. Los datos experimentales (Obs) y calculados (Calc) se muestran para WT, R422Q y P406L, respectivamente. Estas gráficas se derivaron del ajuste de los datos cinéticos dependientes de la temperatura de las reacciones de difenol oxidasa y los datos de asociación computacional. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y las barras de error representan desviaciones estándar.

La Figura 5 muestra las firmas termodinámicas aparentes de las reacciones de difenol oxidasa.

Figura 5. Las firmas termodinámicas aparentes de las reacciones de difenol oxidasa sugieren reacciones impulsadas por fuerzas de entalpía y entropía. WT, R422Q y P406L se muestran en azul, naranja y gris, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y las barras de error representan desviaciones estándar. Las firmas termodinámicas para las simulaciones de acoplamiento se muestran en la Figura S3 de Materiales Suplementarios.

La Tabla 2 presenta los aparentes ΔH y ΔS.

Tabla 2. Entalpía y entropía de WT, R422Q y P406L obtenidas del análisis de Van’t Hoff de las reacciones de difenol oxidasa y simulaciones computacionales.

Se realizaron simulaciones por computadora para evaluar la asociación dependiente de la temperatura entre Tyr y L-DOPA y para explicar las observaciones experimentales. Los gráficos de desviaciones cuadráticas medias de la raíz (RMSD) indicaron que las simulaciones para WT, P406L y R422Q fueron estables(Figura S10 de Materiales Suplementarios). L-DOPA se acopló a Tyr a cuatro temperaturas diferentes y los resultados de acoplamiento solo se consideraron si los grupos hidroxilo en el anillo aromático de L-DOPA estaban orientados hacia el sitio activo de cobre y si la salida de YASARA indicaba que ambos átomos de cobre estaban en contacto con residuos. Los residuos de contacto se calcularon dentro del guión dock_run.mcr. Los grupos hidroxilo estaban situados dentro de dos moléculas de agua (5,5 Å) de cobre. Los resultados del acoplamiento estructural se muestran en la Figura 6 y demuestran la unión de L-DOPA en las proximidades de los átomos de CuA y CuB dentro del sitio activo.

Figura 6. Acoplamiento molecular de L-DOPA y Tyr: (A) Los residuos de WT implicados en el acoplamiento del sustrato a todas las temperaturas se muestran en el sitio activo. Estos residuos incluyen H202, E345, F347, H363, H367 y V377; (B) la molécula de L-DOPA (magenta) está acoplada en el sitio activo de WT. El acoplamiento computacional que se muestra aquí mide la energía de unión de L-DOPA en el complejo enzima-sustrato [Tyr*L-DOPA]. Los dos átomos de cobre en el sitio activo de Tyr se muestran mediante esferas de bronce. Están coordinados por H180, H202, H211, H363, H367 y H390.

Se encontró que cuatro residuos de receptores de contacto estaban involucrados en interacciones de ligandos para estructuras WT, R422Q y P406L a las cuatro temperaturas evaluadas aquí: H202, E345, F347 y V377(Figura S4 de Materiales Suplementarios). Los gráficos del número total de enlaces de hidrógeno en la estructura proteica para WT Tyr y R422Q se muestran en la Figura S9 de Materiales Suplementarios. Se espera que R422Q pierda enlaces de hidrógeno transitorios con residuos circundantes, incluidos E409, E413 y E423. H363 y H367 también estuvieron involucrados para WT(Figura 6),y H367 y S375 para P406L. Constantes de disociación (Kd) se generaron para cada pose de enlace para Tyr (0.018–0.048 mM), R422Q (0.037–0.076 mM) y P406L (0.030–0.064 mM) (Tabla de material suplementario S2). Para cada estructura, Kd aumenta linealmente con la temperatura, mostrando resultados consistentes con la actividad experimental de la difenol oxidasa. Las posturas de acoplamiento describen el complejo Tyr*L-DOPA, y su asociación dependiente de la temperatura produce líneas de tendencia negativas en las gráficas de Van’t Hoff de las tres estructuras(Figura 4),revelando una reacción exotérmica (∆H < 0). La energía libre de Gibbs se calculó para cada temperatura y, posteriormente, el ΔΔG se determinó para R422Q (1.498–1.066 kJ/mol para 28–43 °C), y P406L (0.914–0.614 kJ/mol para 28–43 °C). Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Figura S3 de Materiales Suplementarios. Consistente con los resultados de la cinética experimental, la asociación de Tyr y L-DOPA es una reacción compleja apoyada por fuerzas de entalpía y entropía.

  1. Discusión

Se sabe que el cambio de temperatura causa estrés extracelular [19], pero el papel de la temperatura en la producción de melanina, especialmente en las variantes mutantes OCA1B de Tyr, ha recibido poca atención. Aquí, caracterizamos la cinética dependiente de la temperatura y las firmas termodinámicas de Tyr y dos mutantes relacionados con OCA1B, R422Q y P406L, a cuatro temperaturas mediante el seguimiento de la reacción de la difenol oxidasa. Utilizando las mismas condiciones experimentales, las actividades y estructuras de WT y variantes mutantes se modelaron utilizando dinámica molecular y acoplamiento. El papel de la temperatura en la producción de dopacromo también se evaluó a través de la reacción de difenol oxidasa. Por primera vez, tanto los resultados experimentales como los computacionales revelaron que la asociación de L-DOPA con R422Q y P406L es una reacción apoyada por fuerzas de entalpía y entropía. Además, mostramos que el WT tiene un mayor número de facturación en comparación con R422Q y P406L. Además, la producción de dopacromo aumentó con el aumento de la temperatura para WT, R422Q y P406L, pero fue mayor para el WT a todas las temperaturas examinadas. Dilucidar la cinética y la termodinámica de las variantes mutantes relacionadas con OCA1B nos ayuda a comprender los mecanismos por los cuales disminuyen la actividad catalítica de Tyr.

En nuestros estudios previos, investigamos la actividad enzimática de R422Q [1,2] (a 31 y 37 ° C) y P406L [1] (a 37 ° C). En línea con nuestro presente estudio, encontramos que el Vmáximo, kgato, y los valores de eficiencia enzimática son más bajos para R422Q (kgato = 78,44 ± 9,69 s−1) y P406L (kgato = 72,17 ± 11,07 s−1) en comparación con la del WT (kgato = 128,59 s−1). La Km los valores indicaron que la afinidad de unión es ligeramente mayor para R422Q (0,73 ± 0,12 mM) y P406L (0,65 ± 0,17 mM) en comparación con la del WT (0,85 ± 0,22 mM) [1]. Esto también es consistente con nuestro presente estudio, pero no se ajusta a todos los datos. Por ejemplo, P406L tiene una afinidad ligeramente menor a 31 y 43 °C en comparación con la del WT (Tabla deMateriales Suplementarios S1). En general, tanto los estudios anteriores como los actuales muestran que R422Q y P406L son bioquímicamente similares al WT, pero muestran una actividad enzimática disminuida. En nuestro presente trabajo, determinamos los parámetros cinéticos de R422Q y P406L en más puntos de temperatura (28, 31, 37 y 43 °C) que los realizados anteriormente. También examinamos la producción dependiente de la temperatura de dopacromo y las firmas termodinámicas de R422Q y P406L por primera vez. Además, anteriormente informamos de la cinética dependiente de la temperatura y las firmas termodinámicas de WT [17]. Aquí, investigamos las firmas termodinámicas del control R422Q, P406L y WT utilizando el análisis de Van’t Hoff(Figura 5). Para el control wt, nuestros resultados mostraron que la asociación de L-DOPA y Tyr es una reacción favorable, consistente con nuestra publicación anterior como se muestra en la Tabla 2 (ΔH < 0) [17]. El signo de ΔS es negativo en nuestro presente estudio (WT ΔS = −0,12 ± 0,020) mientras que es positivo en nuestro reciente artículo (WT ΔS = 0,058 ± 0,020). También notamos diferencias en las magnitudes de los parámetros termodinámicos, pero las tendencias generales fueron similares.

En el experimento cinético de Michaelis-Menten, Km aumentado con la temperatura, lo que implica una disminución de la afinidad de L-DOPA por Tyr a temperaturas más altas (Figura 1 y Materiales Suplementarios Tabla S1). Esto es consistente con los datos computacionales que resultaron en el aumento de Kd con temperatura (Tabla de Materiales Suplementarios S2). Asumimos que la formación de producto a partir del complejo L-DOPA*Tyr ocurre a un ritmo mucho más lento en comparación con la tasa de disociación del complejo. En este caso, la Km y Kd los valores son iguales [17]. Desde la Km no cambiaron significativamente entre WT y variantes mutantes a todas las temperaturas evaluadas, las mutaciones probablemente no afectan la afinidad de L-DOPA por Tyr en el sitio activo. Sin embargo, Vmáximo y kgato disminuyó a todas las temperaturas en variantes mutantes en comparación con WT. La eficiencia catalítica, que es el mejor valor para representar la capacidad general de Tyr para convertir sustrato en producto, reveló que las variantes mutantes tienen una eficiencia menor(Figura 2 y Tabla de Materiales Suplementarios S1). Estos resultados nos llevaron a inferir que no podíamos excluir la posibilidad de que las mutaciones pudieran estar afectando la actividad de Tyr alostéricamente. Las enzimas podrían tener sitios reguladores asteréricos compuestos por diferentes residuos lejos de un sitio activo. Estos residuos podrían ser mediadores críticos de las comunicaciones de largo alcance e importantes contribuyentes a la integridad de la estructura enzimática [20]. La sustitución no conservadora de estos residuos podría dar lugar a un cambio conformacional significativo y a una pérdida de eficiencia catalítica. Además, los estudios han demostrado que las perturbaciones mutacionales modulan consistentemente el empaquetamiento y la dinámica de una fracción significativa de residuos de proteínas, extendiéndose >10-15 Å desde el sitio mutado. Esta modulación a largo plazo de la estructura enzimática puede afectar la estabilidad y conformación de las proteínas, permitiendo la modulación alostérica de la función [21].

La inestabilidad alostérica que afecta a la actividad de Tyr, en parte, podría interpretarse a nivel de interacciones interatómicas. La mutación P406L permite la posibilidad de extender la hélice alfa (residuos 384-403) que contiene H390, una histidina coordinadora del cobre. La prolina típicamente introduce una ligera curvatura dentro de las alfa-hélices debido a la falta de un enlace de hidrógeno(Materiales Suplementarios Figura S5). R422 forma tres enlaces de hidrógeno transitorios con E409, E413 y E423. La mutación R422Q elimina el enlace de hidrógeno que acepta la arginina de una bolsa de ácido glutámico(Materiales suplementarios Figura S6). Hasta cierto punto, el cambio en la actividad de Tyr podría atribuirse a los cambios en la estructura y las interacciones debidos a las mutaciones R422Q y P406L. Estos cambios en los mutantes disminuyen Vmáximo y el recambio enzimático. Este fenómeno se muestra en las Figuras de Materiales Suplementarios S7 y S8,donde investigamos los parámetros cinéticos en cinco puntos de tiempo diferentes durante una hora de la reacción de la difenol oxidasa. En general, los resultados de la cinética dependiente de la temperatura indican que las variantes mutantes han disminuido la actividad catalítica en comparación con la del WT.

La cinética de Michaelis-Menten de la reacción de difenol oxidasa y el análisis de acoplamiento in silico de WT, R422Q y P406L exhiben resultados similares con entalpía aparente negativa y término de entropía positiva como se muestra en la Figura 5, Tabla 2,y la Figura S3 de Materiales Suplementarios. El equilibrio entre la entalpía negativa (ΔH < 0) y el término de entropía positiva (−TΔS > 0) impulsa la reacción para hacer que la energía libre de Gibbs sea positiva, por lo tanto, el proceso está influenciado tanto por la entalpía como por la entropía [22]. La entropía negativa, que indica la disminución del desorden en el sistema, también podría estar relacionada con una disminución en la libertad rotacional y traslacional de las moléculas de L-DOPA y dopacromo, o un cambio en la estructura conformacional de la asociación de dopacromo debido a diferentes interacciones. Aunque la entalpía general es negativa e indica una reacción favorable de la difenol oxidasa de WT y variantes mutantes, las interacciones iónicas e hidrofóbicas podrían contribuir a los cambios de entalpía y entropía [23]. En resumen, ambos métodos, la cinética de Michaelis-Menten y el acoplamiento in silico, muestran que la asociación de L-DOPA y Tyr es una reacción (ΔG > 0) apoyada por fuerzas de entalpía y entropía.

El cambio en la actividad de Tyr y el efecto del cambio termodinámico entre WT y variantes mutantes se demuestran por el cambio significativo en la producción de dopacromo a través de la reacción de difenol oxidasa(Figura 3 y Tabla 1). Las variantes WT y mutantes mostraron una mayor producción de dopacromo con el aumento de la temperatura. Como se muestra en la Figura S2 de Materiales Suplementarios,la producción de dopacromo aumentó linealmente con la temperatura, de acuerdo con la siguiente ecuación D = Pd × T − Do. Sin embargo, R422Q y P406L mostraron una menor producción de dopacromo a todas las temperaturas evaluadas aquí. El dopacromo se produce por la interacción de L-DOPA, el sustrato de la reacción de difenol oxidasa, con Tyr, la enzima que cataliza la reacción para liberar dopaquinona del complejo enzima-sustrato. Esto es seguido por la formación de dopacromo a partir de dopaquinona a través de ciclización intramolecular espontánea e intercambio redox. Las reacciones posteriores eventualmente convierten el dopacromo en melanina [12,13]. En la cinética de Michaelis-Menten, medimos espectrofotométricamente la producción de dopacromo a 475 nm, mientras que nuestras simulaciones de acoplamiento delinearon la asociación de L-DOPA y Tyr en la primera etapa de la reacción de difenol oxidasa. Sin embargo, tanto la cinética como los análisis de acoplamiento in silico demostraron resultados similares, entalpía negativa y entropía (Tabla 2). Como hemos demostrado en nuestro reciente estudio [17], esto implica que el acoplamiento in silico, un modelo exitoso del primer paso de la reacción de la difenol oxidasa se correlaciona con los cambios de dopacromo medidos a 475 nm en el último paso de la reacción.

Experimentalmente, medir la asociación de L-DOPA con Tyr y determinar los parámetros termodinámicos detrás de esta asociación es complicado debido a los pasos transitorios involucrados en la reacción de difenol oxidasa. Aquí, sugerimos tener en cuenta el cambio en los valores de ΔΔG entre los datos experimentales y computacionales para obtener una comprensión más precisa de la asociación de dopacromo en la reacción de difenol oxidasa. Los cambios en los valores de ΔΔG entre los datos experimentales y computacionales se muestran para R422Q y P406L en la Tabla de Materiales Suplementarios S3. Estos valores muestran que el cambio en ΔΔG es negativo, lo que sugiere estabilización por dopacromo. Tanto en R422Q como en P406L, el cambio en los valores de ΔΔG entre los datos experimentales y computacionales aumenta linealmente con la temperatura (R ajustado2 = 1.00) según la siguiente ecuación E = Ed × T − Eo (Figura 7).

Figura 7. La diferencia entre ΔΔG experimentalObs y ΔΔG computacionalCalc en función de la temperatura (°C). Aquí, ΔΔG representa el cambio de energía libre obtenido al restar el ΔG del WT del ΔG de las variantes mutantes a diferentes temperaturas. El azul (E = 0.033T − 3.265, R2 = 1.000) y naranja (E = 0.036T − 2.583, R2 = 1.000) las líneas son para R422Q y P406L, respectivamente.

Aquí, E, Ed, Eo, y T denotan el cambio en ΔΔG (ΔΔGObs – ΔΔGCalc), tasa de cambio en ΔΔG, cambio en ΔΔG a 0 °C y temperatura (28, 31, 37 o 43 °C), respectivamente. Los valores correspondientes de estos parámetros para R422Q y P406L se enumeran en la Tabla de Materiales Suplementarios S4. La línea de tendencia positiva que se muestra en la Figura 7 implica una disminución en la estabilidad del producto similar al dopacromo a medida que aumenta la temperatura. Además, los valores más altos de cambio de energía libre para P406L en la Figura 7 demuestran que P406L es más inestable que R422Q. Por lo tanto, el cambio en los valores de ΔΔG podría proporcionar un método fácil para dilucidar la energía de las asociaciones de dopacromo, medir la producción de dopacromo espectrofotométricamente y evaluar la asociación de L-DOPA y Tyr utilizando simulaciones de acoplamiento.

El análisis del vínculo entre la estabilidad de la proteína y la unión al ligando podría ser importante para comprender los mecanismos involucrados en una disminución de la actividad catalítica de las variantes mutantes. Esto también podría sugerir tratamientos potencialmente nuevos para la recuperación de la actividad catalítica de la tirosinasa en variantes mutantes. De hecho, un estudio reciente de Teramae et al. utilizando células HeLa para expresar Tyr mutante demostró que la terapia química con chaperona ofrecía una modalidad de tratamiento prometedora para recuperar la actividad tyr de pacientes con OCA1A con ciertos tipos de mutaciones sin sentido de TYR [4]. El mismo enfoque podría usarse potencialmente en OCA1B para restaurar la actividad de la tirosinasa en áreas más cálidas. Otro método que podría restaurar la actividad de la tirosinasa es el uso de inhibidores del proteasoma [7]. Además, un estudio realizado por Halaban et al. demostró que la coexpresión (expresión ectópica) de la proteína WT con mutantes de tirosinasa sensibles a la temperatura corrigió el defecto de conformación mutante de una manera dependiente de la actividad [24]. Una comprensión de los mecanismos por los cuales los mutantes OCA1B sensibles a la temperatura disminuyen la actividad de la tirosinasa aceleraría la búsqueda de nuevos compuestos para restaurar la actividad de la tirosinasa.

En conclusión, hemos demostrado, por primera vez, que la asociación de L-DOPA con R422Q y P406L es una reacción compleja apoyada por fuerzas de entalpía y entropía similares a la del control WT. Aunque vemos un cambio en la actividad de Tyr en R422Q y P406L, encontramos K similarm valores y comportamiento termodinámico en WT, R422Q y P406L. Esto nos llevó a deducir que el cambio en la actividad podría deberse al efecto alosterico. El análisis de la cinética dependiente de la temperatura nos permite caracterizar mutantes OCA1B y nos proporciona una ruta más fácil para determinar los parámetros termodinámicos aparentes a partir de la medición de absorción. Esto, a su vez, mejora nuestra comprensión de los mecanismos por los cuales las mutaciones de OCA1B disminuyen la actividad de Tyr, acelerando la búsqueda de nuevos compuestos que puedan recuperar la actividad de Tyr en pacientes con OCA1B. Finalmente, además de los estudios in vitro, los estudios in vivo de naturaleza similar junto con la investigación de otros mutantes avanzarían nuestra comprensión de los mecanismos en OCA1B.

  1. Materiales y métodos

4.1. Expresión y purificación de la tirosinasa

Las proteínas mutantes humanas truncadas recombinantes de tipo silvestre, WT y OCA1B relacionadas, R422Q y P406L, se expresaron y purificaron, como se describió anteriormente [1,2,10,16]. Brevemente, las proteínas WT (residuos 19-469 de la proteína de longitud completa), R422Q y P406L se produjeron en larvas enteras de insectos Trichoplusia ni (T. ni). Las larvas infectadas, congeladas a -80 °C, fueron homogeneizadas en tampón de lisis 5×(v/p)(fosfato de sodio de 20 mM, pH 7,4, 500 mM naCl, imidazol de 20 mM, 2 mM MgCl2, 0,2 mg/ml de lisozima de claras de huevo de gallina (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá), 25 μM de 1-fenil-2-tiourea (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.), 40 μg/ml de DNAse (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y comprimidos inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, San Francisco, CA, EE. UU.). Los homogeneizados se incubaron durante 30 min y se sonicaron durante 10 min a temperatura ambiente. Los lisatos se centrifugaron a 8000 rpm durante 30 min a 4 °C, y luego se filtraron para obtener los sobrenadantes, que se diluyeron en una proporción de 1:1 con tampón de unión a afinidad (fosfato de sodio de 20 mM, pH 7.4, NaCl de 500 mM e imidazol de 20 mM). Las proteínas C-terminal 6-His etiquetadas WT, R422Q y P406L fueron purificadas por IMAC seguidas de SEC a temperatura ambiente utilizando estaciones de trabajo de purificación de proteínas puras ÄKTAxpress y ÄKTA, respectivamente (GE Healthcare, Silver Spring, MD, USA).

Los extractos solubles se cargaron en una columna IMAC cruda His-Trap FF de 5 ml (GE Healthcare, Silver Spring, MD, EE. UU.) equilibrada con tampón de unión a afinidad y eluido con tampón de elución de afinidad (fosfato de sodio de 20 mM, pH 7.4, NaCl de 500 mM e imidazol de 500 mM). Las proteínas fueron purificadas aún más por SEC utilizando columnas Sephacryl S-300 HR 26/60, Superdex 200 Increase GL 10/300 y Superdex 75 16/60 HR (GE Healthcare, Silver Spring, MD, USA). Las columnas se calibraron utilizando los estándares de la SEC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.): tiroglobulina bovina, gammaglobulina bovina, ovoalbúmina de pollo, mioglobina de caballo y vitamina B12. Las fracciones que contienen las proteínas WT, R422Q y P406L se identificaron utilizando perfiles SEC y pruebas de actividad colorimétrica que se describen a continuación, y luego se concentraron utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra 10,000 MWCO (Merc Millipore, Burlington, MA, EE. UU.). La pureza e identidad de la proteína se evaluaron mediante SDS-PAGE (Bio-Rad) y el análisis de Western blot utilizando anticuerpos anti-Tyr (T311) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.), respectivamente. Después de cada paso de purificación, las proteínas WT, R422Q y P406L se cuantificaron en A280nm/260nm utilizando un espectrofotómetro Uv-Vis NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

4.2. Ensayo colorimétrico de tirosinasa

La actividad de la difenol oxidasa tyr se midió espectrofotométricamente a 475 nm utilizando una plataforma de detección de lectores de microplacas multimodo SpectraMax i3 (Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.) como se sugirió anteriormente [25,26]. La mezcla de reacción que contenía 0,05 mg/ml de Tyr y 3 mM de sustrato de L-DOPA en tampón de fosfato de sodio de 10 mM, pH 7,4, se incubó durante 30 min a 37 °C y se monitoreó midiendo la formación de dopacromo a 475 nm (εdopacromo = 3700 M−1 cm−1).

4.3. Cinética de Michaelis–Menten

La velocidad de reacción de la difenol oxidasa (Vmáximo) se determinó utilizando 0,05 mg/ml de Tyr y L-DOPA como sustrato a concentraciones de 0,094, 0,188, 0,375, 0,75, 1,5, 3 y 6 mM. Todos los ensayos se realizaron por duplicado en tampón de fosfato de sodio de 10 mM (pH 7,4) durante 1 h a 28, 31, 37 y 43 °C. Las reacciones fueron monitoreadas para la formación de dopacromo a 475 nm con un SpectraMax i3 utilizando una placa de microtitulador de 96 pomos.

Ley de Beer-Lambert, con ε dopacromo = 3700 M−1 y L = 0,3 cm, se utilizó para convertir las mediciones de absorbancia (mOD) de la formación de dopacromo a 475 nm en mediciones de concentración (mM). Los primeros veinte minutos de cada reacción se utilizaron para encontrar la velocidad inicial, Vinicial. Entonces, la constante de Michaelis-Menten, Km, y la velocidad máxima de reacción, Vmáximo, se calcularon a partir de las gráficas de Michaelis-Menten, que fueron equipadas con función polinómica no lineal en OriginPRO Software (versión 7.5, OriginLAB Corporation, Boston, MA, USA). El recambio enzimático (kgato), que se define como el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por enzima por minuto, se derivó de Vmáximo/Et, donde Et es la cantidad total de enzima en nmol.

4.4. El análisis de Van’t Hoff

La firma termodinámica de la producción de dopacromo se determinó mediante la medición de la constante de Michaelis-Menten (Km) a 28, 31, 37 y 43 °C seguido de un análisis utilizando la ecuación de Van’t Hoff. La constante K de Michaelis-Mentenm coincide con la constante de disociación si se asume que la formación del producto a partir del complejo tirosinasa-L-DOPA ocurre a un ritmo mucho más lento en comparación con la tasa de disociación del complejo tirosinasa-L-DOPA (es decir, k2 << k−1 de la reacción) [17]. En esa condición, los parámetros termodinámicos se consideraron valores aparentes. Por lo tanto, la Km los valores a las cuatro temperaturas se graficaron en una gráfica de Van’t Hoff, y luego se ajustó una línea recta utilizando el software OriginPRO (versión 7.5, OriginLAB Corporation) para analizar los datos. El ajuste lineal en la gráfica de Van’t Hoff podría interpretarse con la siguiente ecuación:

ln (Kun/[E]) = (ΔH/R) 1/T − ΔS/R  donde Kun es la constante de asociación (Kun = [E]/Km), Km es la constante de Michaelis-Menten, [E] es la concentración de Tyr en mM, T es la temperatura medida en Kelvin (K), R es una constante de gas (R = 8.31 J/K/mol), ΔH/R es la pendiente y ΔS/R es la intersección y de la línea. Usando ΔH, ΔS y T, el ΔG se calculó para cada temperatura utilizando la ecuación de energía libre de Gibbs (ΔG = ΔH − TΔS). Para obtener valores de ΔΔG, se restó el ΔG de WT del ΔG de los mutantes. Para calcular los cambios de energía libre (ΔΔGObs − ΔΔGCalc) causada por la asociación dopacromo, el ΔΔG de las simulaciones de acoplamiento (ΔΔGCalc) se restó del ΔΔG de los datos cinéticos de Michaelis-Menten (ΔΔGObs).

4.5. Modelado, simulación y acoplamiento mutantes

Una estructura de tirosinasa humana (Tyr) se descargó del sitio web de proteómica ocular(https://neicommons.nei.nih.gov/#/proteome,consultado el 1 de junio de 2021). La mutagénesis global se llevó a cabo en Tyr, y cada mutante se caracterizó por un cambio termodinámico en la energía libre de Gibbs (∆∆G), que se calculó mediante el método semiempírico FoldX y mediante el despliegue de la mutación de la pantalla [27,28]. Tyr es un modelo de homología humana del dominio intra-melanosomal de la tirosinasa humana (residuos 19-469) y fue refinado por 2 ns de dinámica molecular (MD) utilizando la escritura md_run.mcr incorporada a un programa de gráficos moleculares, modelado y simulaciones Yasara [29,30] (http://www.yasara.org, consultado el 1 de junio de 2021). Dos mutantes OCA1B, R422Q y P406L, fueron creados usando la función Edit > Swap > Residue en la estructura Tyr en YASARA. Las estructuras Tyr, R422Q y P406L fueron sometidas a 100 ns de MD en YASARA. El tamaño de la célula se extendió a 10 Å más allá de cada lado de la proteína en forma de cubo con dimensiones de 92,9 × 92,9 × 92,9 Å. El pH predeterminado se estableció en el valor de 7,4, suponiendo una protonación fija para todos los residuos. La concentración de iones se agregó como una fracción de masa con 0.9% de NaCl, y el control de presión se adaptó para permitir una densidad de agua variable para garantizar que la presión se mantuviera en 1 bar a cuatro temperaturas diferentes: 25, 31, 37 y 43 ° C. Se utilizó un campo de fuerza AMBER14 con un paso de tiempo de 2.5 fs. Después de MD, los diferentes archivos PDB se sometieron a acoplamiento molecular utilizando el script dock_run.mcr de YASARA. Se modificó para permitir 200 carreras de acoplamiento para cada par receptor-ligando. YASARA emplea AutoDock Vina [31], un método de optimización de gradiente. El receptor de la proteína tirosinasa se mantuvo rígido y el ligando L-DOPA se mantuvo flexible. El script utiliza una función de puntuación estadística para dar a cada una de las conformaciones de unión receptor-ligando energía de unión y afinidad de unión sin una suposición sobre el pH o las condiciones de sal. Las afinidades de unión y la concentración experimental de enzimas se utilizaron para determinar constantes de asociación a cuatro temperaturas diferentes y para crear una gráfica de Van’t Hoff.

4.6. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por duplicado y las barras de error representan desviaciones estándar de la media. La Km/ <>máximo, kgato se promediaron los valores y otros parámetros cinéticos y se determinaron los errores estándar en cada caso. Para obtener los errores para los parámetros cinéticos y termodinámicos adicionales derivados de los datos experimentales, se utilizaron las fórmulas de propagación de errores adecuadas.

 

Recopilado y traducido al español desde  www.mdpi.com
(Publicado originalmente el 21 Julio 2021)

 

CITA:

Wachamo SA, Patel MH, Varghese PK, Dolinska MB, Sergeev YV. Characterization of Temperature-Dependent Kinetics of Oculocutaneous Albinism-Causing Mutants of Tyrosinase. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(15):7771. https://doi.org/10.3390/ijms22157771

 

DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22157771